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MilliporeECL發光液哪些因素會影響訊號的強弱呢₪✘◕▩▩?
瀏覽次數◕₪✘:716釋出日期◕₪✘:2022-04-21
  MilliporeECL發光液以化學熒光發光方法檢測蛋白質或核酸類生物大分子☁₪◕。其原理是··╃·,蛋白質或核酸在電泳後轉移到印跡膜上··╃·,以抗體及辣根過氧化物酶HRP標記的第二抗體結合膜上的目的蛋白··╃·,或以HRP標記的探針直接或間接結合膜上的核酸☁₪◕。洗膜後用MilliporeECL發光液A液和B液等體積的混合工作液··╃·,在可見光下室溫孵育膜數分鐘··╃·,將印跡膜用保鮮膜包被貼上固定於X光片曝光暗盒☁₪◕。然後轉入暗室將X光膠片壓在膜上曝光數秒到數分鐘至數小時☁₪◕。
 
  MilliporeECL發光液哪些因素會影響熒光訊號的強弱呢₪✘◕▩▩?
 
  1.保鮮膜的質量☁₪◕。a.國產的保鮮膜··╃·,很多廠家偷工減料打價格戰··╃·,造成保鮮膜很薄亦破損☁₪◕。ECL滴加到保鮮膜上容易從肉眼不易分辯的小孔洩露··╃·,一方面ECL反應不充分··╃·,另一方面ECL所含液體會溶解試驗檯上殘留未知的化學藥品顆粒(也許你或其他人曾經不小心打翻過某種化合物)↟₪·、灰塵等等··╃·,造成熒光淬滅☁₪◕。在簡述原理時··╃·,我曾經提到過很多化合物↟₪·、金屬離子能直接催化過氧化物水解··╃·,在極短的時間內消耗掉所有的HRP酶··╃·,熒光轉瞬即逝☁₪◕。
 
  b.保鮮膜的化工原料或拉制過程中··╃·,殘留未知的化學試劑··╃·,引起熒光淬滅;廉價的保鮮膜問題尤多☁₪◕。
 
  目前··╃·,國產的就“妙潔”比較過關··╃·,保鮮膜厚度和化學物殘留都不影響ECL顯影☁₪◕。
 
  如果買不到合格的保鮮膜··╃·,也可以用其他物品替代;但要特別注意這些支援物表面的乾淨··╃·,好不要有任何化學試劑殘留··╃·,包括風乾的TBST鹽結晶顆粒☁₪◕。
 
  2.ECL孵育結束後膜需要控幹☁₪◕。中學物理學過水會吸收光譜··╃·,因此任何液體包括ECL溶液本身都會干擾熒光強度··╃·,所以ECL孵育結束時需要控幹☁₪◕。一般夾起膜··╃·,讓膜的一角或一邊接觸吸水紙;但是請注意不能讓膜*幹掉☁₪◕。某些訊號較弱的ECL··╃·,膜*幹掉後熒光會消失;較好的試劑盒··╃·,熒光相對穩定··╃·,但*吸乾以後··╃·,背景熒光也會升高··╃·,而且會嚴重影響重新標記新抗體時的背景☁₪◕。因此··╃·,按照我的方法··╃·,讓自由流下的多餘的ECL被吸走就好☁₪◕。
 
  3.控乾的膜要仔細用保鮮膜包被··╃·,防止接觸外界異物造成熒光淬滅;同時··╃·,包裹保鮮膜時要細心··╃·,儘量不讓正面保鮮膜和膜之間出現皺褶☁₪◕。皺褶的地方會堆積多餘的ECL··╃·,要麼形成一條熒光的亮線;要麼由於液體吸收熒光或者區域性區域HRP過度消耗··╃·,呈線條狀淬滅☁₪◕。
 
  4.在膜放入壓片夾之前··╃·,好肉眼觀察一下熒光訊號的強弱··╃·,這有利於判斷實驗可能出現的問題☁₪◕。很多人提問看見很強的熒光了··╃·,但怎麼壓片都沒有訊號··╃·,那麼就是快速淬滅(閃滅··╃·,再怎麼快速操作也拿不到這種情況下的熒光訊號)造成的;有這個觀察至少能夠判斷ECL孵育之前實驗操作應該問題不大··╃·,而問題主要是淬滅☁₪◕。如果你省略這個步驟··╃·,那問題就非常複雜了··╃·,因為之前任何操作都可能導致白板··╃·,根本無法判斷☁₪◕。
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